關鍵詞:RNAi質粒載體構建服務|實驗技術服務
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RNAi質粒載體構建服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序實驗流程：
近年來的研究表明,一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型, 稱為RNA干擾（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子,能夠以序列同源互補的mRNA為靶目標,降解特定的mRNA.RNAi的發現具有劃時代的意義,它不僅深入揭示 了細胞內基因沉默的機制,而且它還是后基因組時代基因功能分析的有力工具,極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程.現在越來越多的研究人員開始采用RNAi 來研究生物體的基因表達.RNAi技術可廣泛應用到包括功能基因組學,藥物靶點篩選,細胞信號傳導通路分析,疾病治療等等.
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括：
·化學合成
·體外轉錄
·長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
·siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
·PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
獲得高純度的siRNA產物是進行實驗的**步,而轉染的效率則是非常關鍵的因素.
RNAi表達載體的構建
1. 目的基因的確定
2、設計siRNA靶序列
基本步驟：
（1）將100μl感受態細胞于冰上解凍.
（2）取5μl連接產物加入到感受態細胞中,輕輕旋轉幾次以 混勻內容物. 在冰上放置30分鐘.
（3）將管放入預加溫到42℃的水浴中,熱激90秒.快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻1~2分鐘.
（4）每管中加700μl LB培養基,37℃振蕩培養1小時,進行復蘇.
（5）室溫4,000rpm離心5分鐘,棄去上清后,用剩余100μl培養基重懸細胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面.注意：細胞用量應根據連接效率和感受態細胞的效率進行調整.
（6）將平板置于室溫直至液體被吸收.
（7）倒置平皿,于37℃培養,12~16小時后可出現菌落.